鸡源大肠杆菌TEM-57型β-内酰胺酶基因的原核表达及酶特性

摘要：

【摘要】对该临床菌株进行接合试验,采用PCR扩增获得blaTEM-57基因片段,定向克隆入表达载体pET-28a构建重组质粒,经酶切和DNA测序鉴定后进行诱导表达,用双紫外分光光度仪测定表达蛋白的底物水解特性和抑制剂的抑酶特性。结果显示,耐药质粒成功从供体菌接合转移到大肠杆菌C600,接合子对青霉素类及氨基糖苷类药物耐药。PCR扩增产物电泳出现blaTEM-57目的条带。重组质粒经EcoRⅠ、XholⅠ双酶切及测序鉴定后,显示pET-28α/TEM-57原核表达载体构建成功。原核表达的最优条件为IPTG浓度0.8mmol/L、温度37℃、诱导时间4h。blaTEM-57能水解氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻呋钠、头孢曲松钠、头孢噻肟钠及头孢哌酮,对头孢氨苄的Km最小为2.4,对头孢噻呋钠的Km最大为121.5;抑制剂舒巴坦钠和他唑巴坦对blaTEM-57水解抗生素有不同程度的抑制作用。pET-28α/TEM-57重组质粒得到成功构建和诱导表达,为进一步研究酶的其他特性及制备特异性的单克隆抗体奠定了基础。
【关键词】鸡； blaTEM-57型β-内酰胺酶；克隆；原核表达；酶特性；
【基金】国家自然科学基金资助项目(30771624)

引言：

【引言】革兰阴性菌对β－内酰胺类药物产生耐药的主要原因是产生β－内酰胺酶，而ＴＥＭ型β－内酰胺酶（ｂｌａＴＥＭ）是流行最广且种类最多的质粒编码丝氨酸蛋白酶，其中ｂｌａＴＥＭ－１在革兰阴性菌中最为常见，约９０％对青霉素耐药的大肠杆菌都产生ＴＥＭ－１。目前，ｂｌａＴＥＭ在全世界广泛流行，基因亚型也在逐渐增加。在我国，苑丽曾报道的鸡大肠杆菌ｂｌａＴＥＭ以ｂｌａＴＥＭ－１型最为多见，胡功政等研究发现，产ｂｌａＴＥＭ－１型菌株在药物的持续作用选择下能突变为产其他ｂｌａＴＥＭ基因亚型或超广谱β－内酰胺酶菌株。ｂｌａＴＥＭ－５７型β－内酰胺酶最早于１９９９年被描述，国内无论在人医或兽医方面，研究ｂｌａＴＥＭ的较多，但尚未见ｂｌａＴＥＭ－５７亚型的研究报道。直到２００９年，本课题组检出产ｂｌａＴＥＭ－５７（ＧｅｎＢａｎｋ序列号为：ＦＪ４０５２１１）的鸡大肠杆菌。本试验对ｂｌａＴＥＭ－５７基因进行了原核表达及表达条件的优化，并观察了表达产物的底物水解特性及酶抑制剂的抑酶特性，旨在为兽医临床产ｂｌａＴＥＭ－５７细菌感染的防治提供理论依据。

作者：

吴华；刘保光

作者单位：

河南农业大学牧医工程学院；西藏职业技术学院畜牧兽医系；