鸡去泛素化相关因子1基因原核表达载体的构建及表达

摘要：

【摘要】构建鸡去泛素化相关因子1(Chicken ubiquitin-related factor 1,chUAF1)的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。将提取的鸡法氏囊cDNA根据哺乳动物基因组的特性5′-端GC含量高3′-端GC含量低的特点设计2对引物,PCR获取2段基因片段。将两者用搭桥部分的酶切位点进行酶切,胶回收,连接成chUAF1基因全长,再将基因克隆入pMD18-T载体,酶切鉴定后,将chUAF1基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UAF1。转化BL21(DE3)大肠杆菌中,IPTG诱导表达并鉴定。结果显示,所构建的chUAF1基因表达载体pET28a-chUAF1经PCR及DNA测序结果表明构建正确,SDS-PAGE鉴定在预期位置出现阳性条带。结果表明,已成功构建了pET28a-chUAF1原核表达载体,为下一步试验提供了依据。
【关键词】泛素化相关因子1；构建；原核表达；
【基金】国家自然科学基金资助项目(31272528)

引言：

【引言】去泛素化相关因子１（ＵＳＰ１－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ１，ＵＡＦ１）是一个相对分子质量约为８０　０００的蛋白，其Ｎ－端含有８个ＷＤ重复基序的ＷＤ４０结构域，Ｃ－端是螺旋卷曲域（Ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）。Ｐａｒｋ等人最初的研究发现其为胞内体ｐ８０蛋白，可以与松鼠猴疱疹病毒（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ，ＨＶＳ）的Ｔｉｐ相互作用并导致了溶酶体囊泡的形成。目前的研究发现，ＵＡＦ１ＷＤ４０域结合３种去泛素化酶（ＵＳＰ１、ＵＳＰ１２和ＵＳＰ４６），并能激活其蛋白酶活性。本试验提取鸡法氏囊的总ＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到ｃｈＵＡＦ１片段，并在其两端引入酶切位点ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ，对ｃｈＵＡＦ１片段和ｐＥＴ２８ａ质粒进行双酶切处理，连接后得到重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ｃｈＵＡＦ１并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）中，通过ＩＰＴＧ诱导可以高效表达，利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定表达结果，为下一步研究其与去泛素化酶家族相互作用机理奠定基础。

作者：

赵程程；郑海南；吴山力

作者单位：

吉林大学畜牧兽医学院；吉林大学白求恩医学院；长春师范学院中心实验室；